想得到Akt磷酸化WB，正确处理样本方式

1、诱导方式是否合理大家都知道样本处理是塘垛獯鹤影响整个实验结果的关键，那么到底该如何处理样本才能获得漂亮的磷酸姝耒匝揎化Akt结果呢？必须要注意的是，Akt的磷酸化发生得很快，信号也消失得很快，一般建议对样本做短时间的处理，用Insulin, Calyculin A, PDGF等处理10-30分钟，就可以得到很强的Akt磷酸化结果。详细点说，就是使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060或 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691，对未经处理或经 LY294002/Wortmannin 处理的 PC-3 细胞、经血清饥饿过夜处理或 PDGF（50 ng/mL，10分钟）处理的 NIH/3T3 细胞，可以看到很强的Akt 473位点的磷酸化结果。

2、如果不确定自己的样本是否表达，不用担心，CST还提供商品化的Akt阳性对照Akt Control Cell Extracts #9273S，里面有两管，一管是磷酸化 Akt 细胞提取物：血清饥饿过夜且随后已经 50 µM LY294002 (CST，#9901) 处理 1 小时的 Jurkat 细胞的总细胞提取物，用作阴性对照；一管是磷酸化 Akt 细胞提取物：血清饥饿过夜且随后用 Calyculin A (CST，#9902) 处理 (100nM for 30min)以保持其 Akt 激活状态的 Jurkat 细胞的总细胞提取物，用作阳性对照。大家可以从CST购买，也可以自己制作来帮助判断磷酸化Akt的表达。再来看下insulin处理的例子，可能更短时间的insulin 处理就可以引起Akt的磷酸化表达，在A431 细胞系中加入50nm的insulin， 从2min到30min都可以看到明显的Ser473位点的磷酸化表达。一般而言，也可以用 Calyculin A (100nM for 30min), 或者血清饥饿处理insulin （50-100nM for 5- 10min），对大多数细胞而言都可以得到Akt的磷酸化表达，可以看到在10min的时候信号达到最强，30min的信号弱于5min和10min，所以切记对于Akt的磷酸化表达，处理时间不宜过长。

3、超声处理样本在35-40%的功率条件下破碎3次，每次超声10S，每次间隔10S。30ug左右的蛋白上样量对于组织提取的蛋白，由于只有一小部分细胞可能会发生凋亡。因此，CST 科学家建议每个孔上样 100ug。而对于诱导的细胞系提取的蛋白，20-30ug 就足够了。

4、湿转，70V（250mA），2小时很直白，照做就好。选择合适的抗体简言之就是一看应用，二看种属，如有XP®抗体的情况下，首选XP®级别的抗体。

5、CST作为2018 “年度最高引用抗体品牌”，一直提供的都是高品质的磷酸化抗体。CST是一家由科学家创立的私营家族公司，CST中国（赛信通）是CST在中国建立的独资子公司，董增军（Jay Dong）为赛信通CST（全球）副总裁兼亚太总经理。