拟南芥转基因实验流程

1、拟南芥种子消毒：向装有拟南芥种子的离心管加入1 ml 75%酒精，上下摇晃消毒2 min，再加入1 ml 0.1% HgCl2，消毒5 min，用灭菌水清洗4 ~ 5次，每次2 min，一次将种子均匀吹于MS固体培养基上，吸掉培养基表面多余水分；

2、将处理好种子的MS培养基放于4℃条件下春化3天后，至于组织培养室中培养。条件为：22℃，16 h光照，8 h黑暗；到拟南芥有四片真叶，拟南芥幼苗移栽于营养钵中（营养土:蛭石:珍珠盐=6:3:1），盖上保鲜膜，浇透水，黑暗培养1 ~ 2天后，去除保鲜膜正常光照培养；

3、拟南芥生长至抽苔状态时，应剪掉茎组织，再生长一段时间，使整盘拟南芥全部抽苔，剪掉已经结种子留下花蕾，进行农杆菌侵染实验。

4、将阳性农杆菌在LB（Rif+Gent+Kan）固体培养基划线，28℃，黑暗，培养2 ~ 3天；挑上述平板单菌落，接种于4 ml液体LB（Rif + Gent + Kan）培养基中，28℃暗培养条件下，220 rpm / min摇菌过夜（18 h）；

5、取过夜菌1 m盟敢势袂l，接种于100 ml有三种抗生素的液体（Rif + Gent + Kan）LB培养液中，28℃暗培养条件下，220 rpm / min培养过夜；用紫外分光光度计检测上述菌OD值（OD600在1.2 ~ 2.0之间），倒入灭菌的50 ml灭菌EP中，5000 rpm，28℃离心8 min，收集菌体，弃掉上清培养液

6、用转化渗透液中（100ml：1/2 MS+5%蔗糖 +20µlsilwet）悬浮收集的农杆菌菌体，使OD600苒锃巳伢值约为0.8（菌的活性最适合侵染）；将拟南芥的花蕾部位置于含有农杆菌渗透液的EP管中5 min，侵染结束放于真空干燥器中，待压力上升0.05 MPa时，保持5 min，抽真空完毕，浇水保湿，在黑暗条件下培养24 h后正常培养。