如何验证引物的特异性

1、打开浏览器，输入进入NCBI网站

2、在此网页下方处找到Primer-BLAST，点击进入

3、点击进入以下界面，在Primer Parameters里面输入自己已经设计好的引物序列，在此以病毒DNA序列为例子进行阐述，该引物为扩增EB病毒（人类疱疹病毒4型）DNA一段序列的引物。

4、随后，在Primer Pair Specificity Checking Parameters里面的Databse中选择选项“Genome（chromosomes from all organisms）”，由于举的例子是扩增病毒DNA的引物，用于扩增患者是否携带该病毒，所以要避免该引物扩增出人体DNA中的片段，从而在下面“Organism”里面选择“Homo sapiens”

5、之后直接点击页眉左下角的“Get Primers”按钮进行引物特异性的验证，点击后的页面如图所示。

6、大概稍等一会儿，就会得到结果，结果页面如下图。本条引物在扩增时可能会出现两天杂带，但是该段引物序列与人基因组序列还是存在碱基的不一致，所以也可能扩增不出来，另外产物的片段大小与目的片段大小差异较大，故本对引物的特异性很好!