Everlab云端实验实验方法：脉冲场凝胶电泳实验

1、脉冲电场凝胶电泳的D鲍伊酷雪NA样品的制备： 为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)作为例子。 1) 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g 离心5min。 2) 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min。之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。 3) 取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC 缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。 4) 对于每一个菌株，需要15～20 个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase)的10mL EC 缓冲液中，于37℃振摇过夜。 5) 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50℃轻度振摇温育48h。 6) 将凝胶块放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF)的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次)，以灭活ESP 中的蛋白酶K。 7) 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次)，置于TE 中4℃保存。

2、 限制酶消化： 提高PFGE 的分辨率取决于100～1000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。 1) 25μL10×反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250μL 混匀。 2) 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求)后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。

3、应用PFGE 对样品DNA 进行分析： 1) 用0.5×TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用Wide Minisub Cell 进行电泳的话，50mL该溶液即可。 2) 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。(若样品在溶液中，以l:1 的比率与50℃2%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中)。 3) 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。 4) 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain)或打开变速泵至40。 5) 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于50kb 的限制性片段在0.4s正向和0.2s 反向的电脉冲(比率为2:1)下得以分离，时间为3～5h。 6) 在0.5μg/mL溴化乙锭中进行染色并拍照。

4、​ 分离、纯化大的DNA片段： 1) 凝胶染色、分析后，在目的带前(靠近正极处)切一个0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。 2) 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA的迁移，当目的带进入Seaplaque凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP管中。 3) 加入2μL 的tRNA，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸馏水，在65～70℃之间，化胶并保温10min。 4) 苯酚/氯仿500μL 抽提两次。 5) 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L，pH5.2)于-70℃10min 沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE 缓冲液中。