小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养

1、颈椎脱位杀死小鼠（Balb / c，6-8周龄）；用70％乙醇浸泡；将后肢皮毛剥除；沿着脊髓切开，从身体的躯干解剖后肢，小心不要损伤股骨；将后肢储存在DMEM+1% P/S中等待进一步解剖

2、进一步解剖后肢。通过切开膝关节来切开每个后肢；从胫骨和股骨中去除肌肉和结缔组织；将骨干刮干净；将四肢储存在DMEM+1% P/S中

3、超净台操作（提前照紫外，注意无菌操作）：切断骨髓腔末端下方的胫骨和股骨的末端诋危族枧；将装有完整培养基的10 ml注射器上的27号针头插入通过移除生长板暴露的海狡鹃妙兕绵状骨中，用1ml完全培养基将骨髓塞从骨头切开的末端冲洗出来，收集在冰上的10ml管中（关键步骤在骨髓细胞制备过程中，必须进行强力清洗）

4、通过70mm过滤网过滤细胞悬液，以去除任何骨针或肌肉和细胞团块； 通过台盼蓝排除法测定细胞的产量和活力，并在血细胞计数器上计数（一只小鼠7×107）

5、在95mm培养皿中培养BM细胞，在1ml完全培养基中，密度为25×106个/mL细胞（基于步骤4中获得的细胞计数）；3h后更换新的完全培养基

6、再培养8小时后，用1.5ml新鲜的完全培养基替换培养基；此后，每8小时重复该步骤，直至72小时的初始培养（下图为自己做的原代结果）

7、用PBS洗涤贴壁细胞（第0代），每3-4天加入新鲜培养基；初始贴壁纺锤形细胞第3天饺咛百柘显示为单个细胞； 在4-8天内，培养物变得更瑕铆幌约加清晰，并在2周内达到65-70％的影响；（ 在这个阶段，培养物通常表现出两个特征：首先，平板可能含有不同大小不同的成纤维细胞集落; 第二种可以包含散布在细胞集落之间或之上的非常少量的造血细胞）

8、在开始培养2周后，用PBS洗涤细胞，用0.5ml 0.25％ TE/ 1mM ED哌囿亡噱TA在室温下孵育2min；加入1.5ml完全培养基中和胰蛋白酶，将所有消化下来的细胞在T25培养瓶中培养( 传代的时间和温度非常重要, 如果时间和温度分别高于2分钟和25℃，非MSCs和mMSCs将从塑料培养皿中浮起）

9、后续每3天更换培养基（每次更换6 ml培养基）；一般7天内达到传代密度