灵芝多糖的提取分离及结构鉴定
(一拘七呷憎)灵芝多糖的提取分离
灵芝属中灵芝多糖是由一种或多种单糖，并由一个糖的还原性端基C1与另一糖C2、C3、C4或C6的羟基彼滠锖斟绸此脱水缩合的大分子化合物，结构复杂，不具有原来单糖的性质，成为无味的碳水化合物。灵芝多糖，能溶于水(温、热)，不溶于或难溶于醇(乙醇、甲醇)、醚、丙酮等有机溶剂。少数能溶于二甲亚砜等溶剂。可溶于稀碱、稀酸溶液。因此，利用多糖的溶解性质，通常实验室均采用热水提取，即以水为溶剂于90-100℃加热提取，将提取液浓缩后，加入数倍量乙醇使多糖沉淀析出，所得多糖，因内含蛋白质杂质，实验室常用Sevag法(①氯仿+正丁醇5:1V/V；或②氯仿1/5+异戊醇1/15V/V)除去游离蛋白质。其法是将氯仿+正丁醇(5/1 V/V)混合液加入粗多糖水溶液中，多次振摇，使蛋白质变性，在乳化层中除去，反复多次操作，除尽游离蛋白质，并用透析法除去小分子杂质，再加乙醇使多糖沉淀为灵芝总多糖(粗多糖)。何云庆、李荣芷等介绍，在提取时，先用乙醇或甲醇同流提取，残渣除尽醇以后再用水提取，也有用二氯甲烷处理后，再进行提取，但要注意防止降解，稀碱提取液应迅速中和、透析，也可用酸或乙醇沉淀得碱溶性多糖。
(二)多糖的纯化和纯度测定
除去游离蛋白质及小分子杂质后得到的灵芝总多糖是由多个均一体组成，相对分子质量分布范围较宽，不适宜进行化学测定和分析，需进一步分离纯化得到相对分子质量范围较窄的单一组成。灵芝多糖常用的分离纯化方法有：分部沉淀法、凝胶柱层析法、纤维素阴离子交换柱层析法、季铵盐沉淀法等。
①分部(分级)沉淀法。依据多糖相对分子质量的大小，在不同浓度的醇(乙醇或甲醇)中溶解度不同，依次沉淀析出。何云庆、李荣芷研究赤芝多糖(灵芝多糖)的有效部位时，将水提浓缩液加入乙醇成30%浓度析出沉淀，除蛋白质后得A部分；再加乙醇使成60%浓度析出沉淀，除蛋白质后得多糖B部分；再加乙醇浓度达90%析出部分，再除去蛋白质后得多糖C部分。将多糖A、B、C分别进行筛选，找到活性最好的部位进行深入研究。
②凝胶层析法。葡聚糖凝胶，它是一种分子筛，由于含有大量的羟基，故具有亲水特性，能在水解质中溶胀成凝胶粒子。采用凝胶为固定相，使多糖按分子大小不同而获得分离。常用的凝胶为葡聚糖凝胶(Sephadex G-lOO，G-75，G-50)及琼脂糖凝胶，洗脱剂以低浓度盐溶液为宜，如0.1mol·L-1，NaCl(0.1%)。用琼脂糖凝胶柱层析，常用Sepharose 4B及6B已实际应用时可以根据要分离纯化的多糖相对分子质量大小不同，选择不同型号的凝胶，也可应用凝胶柱层析除去小分子杂质(脱盐)等。除上述凝胶外，还有(CM-Sephadex)-羧甲基交联葡聚糖凝胶。磺丙基交联葡聚糖凝胶等。
③纤维素阴离子交换柱层析法。常用的阴离子交换纤维素为二乙基氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)，由于分子中引入阴离子，它是一种弱碱性阴离子交换剂，具有亲水性，可以将酸性多糖、中性多糖分离。一般相对分子质量较大、酸性强的多糖由于吸附力较强，可以与其他类型多糖分开。实际应用中，可将DEAE纤维素予以处理成硼酸型，将中性多糖上柱后，依硼砂溶液浓度递增的条件逐个洗脱，可以分离多个结构不同的中性多糖。目前这个方法在多糖分离中应用很普遍，分离效果好，且能使带色素的总糖的色素部分留在柱上除去，得到纯的均一体。除DEAE纤维素外，尚有将与葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶结合的吸附剂，DEAE-Sephadex，DEAE-Sepharose，既有阴离子交换作用，又有分子筛作用。
④季铵盐沉淀法。1971年Sasaki T等在分离树舌灵芝的多糖时．采用CTA-OH(氢氧化十六烷基二甲胺)，将多糖沉淀析出，然后再以乙醇分部沉淀，得G-F、G-D、G-Z部分进行抗肿瘤活性筛选。季铵盐除CTA-OH外，还有CTAB(十六烷基三甲胺溴化物及CPC十六烷基吡啶)。它们能使酸性多糖形成不溶性复合物，可与酸性多糖，中性多糖分开。
灵芝多糖经纯化后得到的单一组分，它们只是相似链长的有较窄相对分子质量分布范围的均一体，它的纯度测定与灵芝中三萜酸不同。测定多糖纯质的方法，有凝胶过滤法、超迷离心法、旋光测定法、凝胶电泳法、高压电泳及高效液相层析法等。
(三)灵芝多糖的相对分子质量测定
凝胶过滤是根据灵芝中不同相对分子质量的多糖在一定型号的凝胶柱上与洗脱体积成定量关系，常用的为Sephadex，型号G100，用已知相对分子质量的葡聚糖系列上柱，求出洗脱体积与相对分子质量标准曲线．测定未知灵芝多糖的洗脱体积，求出它的相对分子质量值。
尚效液相色谱法测定相对分子质量，其原理是以双蒸水为洗脱剂，以标准相对分子质量葡聚糖(MW)分别测得保留时间(RT)，再将未知样品在标定的条件下进行分析，测定保留时间，计算实验结果。
(四)灵芝多糖的结构测定
目前关于灵芝属中分山的灵芝多糖结构，主要为平面结构(初级结构)，初级结构的测定可以阐明组成多糖的各种单糖的类型及分子(摩尔)比；每个单糖残基的D型或L-型．吡喃或呋喃环形式；各单糖残基连接的次序，连接方式；端基碳(异头碳)的甘键。α-或β型，多糖有主链及侧链以及糖链与非糖部分(肽链)的连接点。
单糖的鉴定常用纸层析，气相层析等。关于多糖结构鉴定有光谱分析法、核磁共振波谱法(氢谱、碳谱)、质谱、气相色谱分析法等。糖链结构的化学分析：酸水解，选
择性酸水解、甲醇解、乙酰解、过碘酸氧化、Smith降解、经典甲基化、箱森法甲基化、β-消去反应及酶解等。文献介绍方法很多，读者可以参见吴东儒主编，《糖类的生物化学》一书中有关多糖结构的测定。
(五)光谱分析
①红外光谱(IR)。灵芝多糖系多个碳水化合物聚合而成的大分子化合物，主要存在有羟基、氨基、酰胺基及碳氢等功能团，这些特征吸收峰出现，就能很快知道该多糖的主要特征，确定该多糖是α-构型，还是β-构型。例如Kazwos等从灵芝中分离出一种水溶性多糖GL-A，红外光谱测定显示920cm-1，1430cm-1，1610cm-1处有特征峰，推测该多糖属β-苷键，目含羧酸基团。在吡喃糖苷键的构型中如果α-型的端基差向异构体，C-H取平伏键，在844cm-1±8cm-1处有一吸收峰；β-构型差向异构体C-H为直立键，则在891cm-1±7cm-1处有吸收峰。在杂多糖或有甘露聚糖形式存在时，则在875cm-1处有吸收峰，当有岩藻糖或鼠李糖等糖时，在967cm-1±6cm-1处有吸收峰，半乳吡喃糖残基则在875cm-1处有吸收峰。
多糖羟基在3700-3100cm-1处吸收峰特别强。根据红外光谱吸收峰的情况，就可以初步判断多糖性质、构型，并借助其他鉴定手段加以确证。
②1H和13C核磁共振波谱。1H-NMR主要解决多糖结构苷键的构型，α-构型还是β-构型，多糖中氢质子信号在δ4.0-5.50 ppm范围。α-型吡喃糖基C1位上质子>5.0 ppm，而β-型<5.O ppm。应用1H-NMR仪时，磁场强度大于300 MHz，如500MHz，650MHz时，测出氢质子信号清晰、精确。特别是对复杂分子多糖，仪器的灵敏度和分辨率十分重要．其对推断结构十分有用。
13CNMR的化学位移较1H-NMR为广，其化学位移可达200ppm。既可以确定各种碳的位置，又可区分单糖的构型和构象，利用峰的相对高度定晕测定多糖中不同残基的相对比例，多糖中残基取代位置和分枝点。
1993年从长白山松杉灵芝(木灵芝，松杉树芝)子实体中分离纯化得水溶性多糖GF3，其13C-NMR有吡暔糖基为1-(103.66ppm)，1-6(103.66→70.24)，1-3(103.55→86.3)，1-4(103.66-80.1)葡萄糖(半乳糖)基存在，均为β-键型。
③质谱(MS)。多糖的质谱分析，主要应用在多糖甲基化水解产物的鉴定，常用GL-MS联用，分析单糖甲基化产物的性质，推测多糖中单糖的排列顺序，主链，侧链及连接点。
(六)多糖结构分析的化学方法
①完全酸水解。中性多糖采用稀疏酸(1-1.5mol·L-1)，100℃加热2-4小时，含有已糖醛酸的酸性多糖较难水解，则要用三氟醋酸或稀硫酸、稀盐酸在封管内100℃加热水解8-12小时，水解产物除去过量的酸及无机离子，可以纸层析或薄层层析鉴别单糖种类：在用气相色谱时，必须做成三甲硅烷衍生物及糖醇乙酸酯衍生物使之挥发，便于GC分析，GC法不仅能检测单糖种类，还能定量分析组成单糖的分子(摩尔)比。
②过碘酸及其盐的氧化反应。该反应可以选择性氧化多糖中连二羟基或连三羟基，生成相应的多元醇或甲酸，反应在pH3-5，低温(4℃)，避光条件下进行，每开裂一个C-C键消耗一分子过碘酸。从消耗的过碘酸及其盐的量、甲酸生成量的分析计算，可以测定多糖的苷键位置、直链多糖的聚合度及支链多糖分枝数目等。例如：葡聚糖如以1→2或1→4糖基聚合，过碘酸氧化平均每个糖基仅消耗一分子过碘酸，无甲酸生成；以1→3苷键相连则与过碘酸无反应，以l→6苷键相连或非还原性末端存在，过碘酸氧化每个糖基消耗二分子过碘酸，且有甲酸生成。根据过碘酸氧化后生成的产物可以了解多糖中连二羟基、连三羟基的状况。
③Smith降解。鉴于多糖在过碘酸氧化中，产生“二醛”类碎片，往往导致“超氧化”作用。1952年Smith等提供一种方法，用硼氢化钠使多糖被过碘酸氧化产生的醛基还原成相应的羟基化合物，具有这样无环缩型结构的糖苷键，易被很稀的酸完全水解。由于连接键的稳定性不同，产生的寡糖能反映原始糖苷键特征。Smith降解法，实际上过碘酸氧化多糖的末端分析。
本法是过氧化产物还原成多元醇(羟基化合物)，在无机酸作用下进行酸水解或部分酸水解。常用的还原剂为硼氢化钠或硼氢化钾，反应完全后于100℃稀酸水解．对所生成的丙三醇、赤藓醇及单糖川纸层析或制备成三甲基硅烷醚衍生物进行气相分析。以葡聚糖为例，1→2，1→6苷键聚合或具有分枝末端，Smith降解产物均有丙三醇(甘油)产生，但1→2甘键无甲酸生成；1→3苷键相连，不发生过碘酸反应。Smith降解反应以后，有葡萄糖生成1→4甘键相连，过碘酸氧化反应后，Smith降解，酸水解产物为赤藓醇。将过碘酸氧化反应与Smith降解的结果综合分析，基本可以确定灵芝多糖组成的种类、比例、键型及分枝点等。
④甲基化反应。多糖分子中的羟基与甲基化试剂(二甲基亚磺酰阴离子于二甲基亚砜)反应，然后水解生成部分甲基化的单糖，经甲基化生成衍生物可以推测多糖分子中各单糖间结合位置，并由不同类型甲基化的单糖数目可以推测多糖中重复单元结构的数目、末端糖的性质和分枝点的位置。红外光谱3300-3600cm-1处无羟基吸收表示反应完全，酸水解后产物可乙酰化或硅烷化后生成物进行气相色谱分析，或GC-MS分析。
⑤O-糖苷键的稀碱水解(β-消除反应)。在灵芝多糖中有糖肽存在时，为了确定糖链与肽链的连接方式，采用温和碱降解，当糖链与肽链的丝氨酸或苏氨酸相连时，β-位羟基之间形成的O-糖苷键对碱不稳定，而N-型糖链在稀碱作用下不能水解。在0.05-0.5mol·L-1NaOH溶液下温和(0-45℃)水解，在反应时加入硼氢化钠，水解后丝氨酸生成丙氨酸，苏氨酸生成α-氨基丁酸。可定性定量测定水解前后丝氨酸、苏氨酸的减少及丙氨酸、α-氨基丁酸的增加值，推测肽多糖中糖链与肽链的连接方式。
⑥酶解法。利用酶对糖苷键的专一酶解的特性，可以了解多糖中糖与糖之间苷键的构型，常用糖苷酶有β-D-葡萄糖苷酶，β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、麦芽酶等。
在研究赤芝子实体热水提物中分离出灵芝多糖GLA有免疫调节、抗氧化活性进一步的DEAE纤维素柱分离出三个肽多糖，其中高效液相法测得相对分子质量为14000，红外光谱在895cm1处有吸收峰，表明为β-吡喃型糖，在3394，1609，1415cm-1有酰胺基特征峰，元素分析有C、H、N，也证明它含肽链。完全酸水解，纸色谱及气相色谱检识，仅有葡萄糖存在。过碘酸氧化，Smith降解，检出丙三醇、赤藓醇，并有甲酸生成。将GLSP3全甲基化，再水解，还原，乙酰后进行GL-MS分析表明葡萄糖基有葡萄糖(1→)、葡萄糖(1→4)及葡萄糖(1→6)三种连接方式，残基数比为3:1:1，结合光谱分析证明糖链由等比例的β(1→6)、β(1→4)连接，并有多个非还原性末端葡萄糖基存在。肽链部分经氨基酸分析，由14种氨基酸组成，β-消去反应，丝氨酸降解反应前为0.59%，反应后为0.26%；苏氨酸由0.60%减到微量，并在紫外光谱240nm处出现吸收峰，由此证明该肽多糖的肽链是由丝氨酸、苏氨酸与糖链以O-糖苷键相连。
2000年进行了灵芝菌发酵培养基优化及灵芝胞外多糖的分离纯化的研究。采用正交法研究了不同条件对灵芝菌生长影响，从中选出了灵芝菌液体深层发酵的优化培养基：葡萄糖3.6%，蛋白胨0.4%，pH6.0，酵母膏0.2%，过磷酸钾(KH2PO4)0.1%，硫酸镁(MgSO4·7H20)0.05%，维生素B1 0.005%，每升发酵液产菌丝体15.6g，粗多糖0.72g。经葡聚糖凝胶层析对灵芝胞外多糖进行了分离纯化，共有5个组分，并用红外光谱、紫外光谱、气相色谱等手段进一步分析了灵芝胞外多糖的组成。结果表明：灵芝胞外多糖系由甘露糖醇、果糖、葡萄糖通过β-D-糖苷键构成。