TRAF基因和TAK基因的克隆方法

1、首先，在根据GenBank中已提交的鱼类TRAF6和TAKIcDNA序列的保守区设计兼并引物(TRAF6-F/TRAF6R;TAKI-F/TAK1-R)。

2、然后，扩增TRAF6和TAKI基因的核心片段。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，与PMD18-T(TaKaRa,Japan)载体连接，转人trans5a感受态细胞中，筛选阳性克隆进行测序。

3、然后，通过BLAST比对分析后获得TRAF6和TAKI基因的核心片段，根据得到的核心片段设计RACE特异性引物(表1),利用巢式PCR扩增TRAF6和TAKI基因的5'和3'末端。

4、然后，在电泳检测目的片段后，连接到载体，转化trans5a感受态细胞，筛选阳性姨捃孜粹克隆送测序。BLAST分析测序结果，Seqman软件拼接得到的序列，最终获得半滑舌鳎TRAF6和TAKI基因全序列。

5、然后，进行序列比对和系统进化分析，利用EditSeq软件预测TRAF6和TAKI基因的开放阅读框(ORF)及可能编码的氨基酸序列。

6、最后，预测和分析蛋白结构城，在NCBI数据库中搜寻其他物种的TRAF6和TAKI的氨基酸序列，利用MEGAS.O软件，以Neighborjining法构建系统进化树。