外周血白细胞DNA的提取（SDS裂解法）

一.实验目的

掌握SDS裂解法提取全血D绿覆冗猩NA的原理与操作步骤。

二.实验原理

利用中性去污剂NP-40破坏全血的红细胞膜，离心弃去溶血液，收集白细胞沉淀，加入去污剂SDS以破坏白细胞核膜，并使核蛋白解离，再加入高浓度的NaCl使DNA溶解，同时使蛋白盐析。通过离心收集水相，加2——2.5倍体积的无水乙醇，沉淀DNA。

三.仪器与试剂

1.仪器

离心机、枪头、移液器、Ep管（1.5ml)

2.试剂

（1）20%NP-40、10%SDS、6mol/LNaCl、冰乙醇、70%乙醇。

（2）低盐缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH 7.6),10mmol/L KCl,2mmol/L EDTA,4mmol/L

MgCl。

（3）TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1mmol/L EDTA(pH 8.0)

四.实验步骤

1.取EDTA抗凝血0.4ml,加入低盐缓冲液1ml,混匀。再加入20ul20% NP-40,充分混匀溶血，此刻应看到溶血液变得透亮。

2.6000r/min 离心5min,弃溶血液，收集白细胞沉淀。

3.加入低盐缓冲液1ml,洗涤白细胞，6000r/min 离心5min,弃溶血液。如果白细胞沉淀中还存在红细胞碎片，可再重复此步骤一次。

4.加低盐缓冲液200ul重悬白细胞沉淀，充分混匀。再加入10%SDS 15ul,混匀，室温下放置5min,使细胞充分裂解。加入SDS后操作要轻柔，避免产生的机械力是基因组DNA断裂。

5.加入6mol/L NaCl溶液75ul,充分混匀，120000r/min 离心10min。

6.将上清液转移到另一 Ep管中，加2——2.5倍冰乙醇沉淀 DNA，120000r/min 离心10min。如果吸取的上清液混有沉淀，可以重新 12000r/min 离心一次，收集上清，加无水乙醇沉淀。

7.收集DNA 沉淀，弃去冰乙醇，仔加入70%乙醇洗 DNA一次，12000r/min 离心 10min,弃去乙醇。

8。风干乙醇后，加入50——100ul TE缓冲液溶解基因组DNA。

五.注意事项

1.红细胞裂解一定要完全，否则影响基因组DNA的质量。

2.乙醇风干要控制时间，过度干燥的DNA不易溶解。

3.加入NaCl盐析，离心沉淀蛋白后，吸取上清一定要小心，不能吸到蛋白质沉淀，否则影响提取到的DNA纯度。

六.临床意义

基因组DNA提取是临床上进行基因诊断和基因治疗等分子生物学检测技术的基础。完整且纯度高基因组DNA可为PCR技术和分子杂交技术等提供模板。