骨组织RNA提取方法及步骤

1、第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!取1ml裂解液 CLB至离心管内(如果C雉搽妤粲LB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入100μl PLANTaid，颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。液氮研磨法:a. 骨钳夹碎骨组织后放入研钵（研钵在180度干烤2小时），加入液氮后反复研磨成细粉，注意液氮蒸发后不断补加保存液氮一直存在。b. 转移100mg细粉加至预热的裂解液CLB（已加有PLANTaid）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。c. 立刻接操作步骤的步骤3。

2、其它骨组织破碎方法：a. 取100mg骨组织加入1ml预热的裂解液CLB（已加有PLANTaid）高速均质仪粉碎匀浆。或者取100mg液氮冷冻包埋切片粉碎的骨头加入裂解液CLB（已加有PLANTaid）粉碎匀浆。b. 立刻接操作步骤的步骤3。

3、短时放回65°C水浴中（10min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。

4、将裂解物4°C 13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

5、取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。

6、将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

7、将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或藤舔趾贶者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清坛冰核哧除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

8、立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

9、加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

10、加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。

11、将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

13、如果预期RNA产量>30μg，加补朱锚卦30-50μl RNase free water重复步骤12，合并怎剑词阶两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。