多糖多酚/复杂植物RNA提取方法及步骤
1、第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!取1ml裂解液 CLB至离心管内(如果C雉搽妤粲LB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入5% β-巯基乙醇（1ml CLB加50μl β-巯基乙醇）。颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。1. 直接研磨法（实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法）:a. 新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100-200mg（水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）迅速剪成小块放入研钵，加入 1ml CLB（已加有β-巯基乙醇）室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液CLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。β-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%。b. 将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。13，000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。c. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。d. 立刻接操作步骤的步骤3。
2、液氮研惜投赃霞磨法（适用广泛，提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法）:a. 液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。b. 转移100-200mg细粉（水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有β-巯基乙醇）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。c. 短时放回65°C水浴中（5-10min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。d. 将裂解物13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。e. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。f. 立刻接操作步骤的步骤3。
3、将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
4、将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
5、立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
6、加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
7、加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。
8、将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
10、如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase free water重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
11、DNA酶柱上消化1. 按照前面所列操作步骤涠础险渥操作，直到做完操作步骤5。2. 取45μl DNase I buffer和5μl RNase free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液（处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液）。3. 向吸附柱RA 中加入350μl去蛋白液RW1，12,000 rpm 离心30 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。4. 向吸附柱RA 中央加入50μl的DNase I 工作液，室温（20℃-30℃）放置15 分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触，不要让工作液滴在O型垫圈或是离心柱管壁上挂壁或者挂在垫圈上不能充分和膜接触。5. 向吸附柱RA 中加入350μl去蛋白液RW1， 12,000 rpm 离心30-60 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。接操作步骤7完成后续步骤。
12、RNA含量少样品或者RNA复杂产量低的解决方案 可以提高样品处理量到300-500mg/2ml裂解液CLB，上清过两根基因组DNA清除柱子，洗脱下来的RNA，可以两个合并到一根RNA吸附柱上，可以大大提高RNA浓度。