BLAST工具基因序列的生物信息学分析方法

1、首先，使用NCBI对序列进行同源性比对和相似性分析，使用软件DNAMAN5.0和DNAsist20对cDNA序列进行分析得到氨基酸序列。

2、然后，并推断分子量，采用DNAMAN5.0软件进行氨基酸序列比对，使用SeaView,以邻位相连法构建系统进化树。

3、然后，利用绝对荧光定量PCR检测IRF3基因，以pMD18-IRF3a为模板按曳骣苷镐照质粒提取试剂盒的说明提取质粒。经微量核酸测定仪测定质粒的浓度及纯度，并依据公式:质粒拷贝数=(6.02x1014x质粒浓度)/[(2692+目的基因片段长度)x660][16,计算出质粒的拷贝数。

4、然后，将标准质粒用双蒸水稀释成1010~10?copies/uL的9个梯度，选取107、100、105、104、103、10这6个梯度作为模板，以IRF3F3和IRF3R3(表1)为特异引物，进行荧光定量PCR反应，每个反应设置3个重复。

5、然后，反应在Chromo4Real-TimeDetectionSystem(MJResearch)上进行，实验操作根据GreenTwo-StepqRT-PCRSuperMix荧光定量PCR试剂盒说明进行，反应体系为20μL。

6、最后，反应程序为:95°C预变性30s;95C变性5s;57°C退火15s,72°C延伸15s,共桃轾庾殇45个循环;55°C30s,每30s升温0.5"C,共进行81个循环达到95°C。反应结束后对扩增曲线和熔解曲线进行分析，制作标准曲线。