制备CIK细胞的流程与方法

1.由医护人员抽取患藤舔趾贶者外周血50~60ml，将其收集于肝素瓶中，37℃室温存放即可；

2.在超净台上使用2支50ml离心管分别装入20ml的淋巴分离液；

3.按30ml/支病人外周血用毛玻璃吸管转移至装有淋巴细胞分离液的离心管中(注意外周血需要放在淋巴细胞上层)；

4.20℃、800g、离心15min；

5.离心结束后使用负压器将离心管中的血浆尽可能多的吸除，将所得的淋巴细胞层细胞转移至另一只50ml离心管中；

6.按照500ml生理盐水配8万单位庆大霉素的剂量，将160IU/ml的庆大霉素生理盐水溶液加入到50ml离心管中充分混合均匀后，20℃、1800~2000r/min、离心8分钟，结束后洗涤1至2次；

7.离心和洗涤均完成后，弃上清再将其移至175cm²的培养瓶中在饱和湿度37℃、5.0%二氧化碳培环境中培养24小时；

8.培养完成后加入1ml的CIK细胞混合因子最终浓度为50～100ng/mlAnti-humanCD3、50～1000IU/mlIL-2、0.5～1ng/mlIL-1α然后继续放置在饱和湿度37℃、5.0%二氧化碳培环境中培养；

9.培养到第五天时，观察细胞的生长状态，将CIK细胞传代支2个175cm²培养瓶中每瓶容量125ml放置在饱和湿度37℃、5.0%二氧化碳环境中培养；

10.培养至第七到第八天时，观察细胞生长状态，由2个175cm²传代扩增培养至4~6个175cm²培养瓶中继续培养；

11.培养至第九到第十天时，观察细胞生长状态继续传代培养扩增为12瓶；

12.培养至第十一到第十二天时，观察细胞生长状态，随即取样抽取1ml细胞培养液置于15ml离心管中送检，然后继续传代扩增至24瓶，详细记录信息后送去做细菌检测；

13.培养至第十四到第十五天时，了解检验结果是否符合要求，观察细胞生长状态后，随即取样5ml培养液做细胞活数统计并进行内毒素检测。如果检测结果符合标准收集24瓶CIK细胞至50ml离心杯中，室温、2500r/min、离心8分钟；

14.离心结束后弃上清，将细胞收集到4支50ml离心管中，用0.9%生理盐水平衡离心管2000r/min离心8min清洗收集；

15.离心结束后弃上清，将细胞集中到2支50ml离心管中使用0.9%生理盐水平衡离心管继续2000r/min、8min离心；

16.最终将收集的细胞置于100ml0.9%的生理盐水中，抽取5ml20%人血蛋白加入到细胞悬液中。抽取1ml细胞悬液支玻璃安瓿做好记录和标记置于-4℃存放3个月用以备查。